補料分批發(fā)酵是最重要的一種生產(chǎn)模式，是指在無菌條件下向發(fā)酵系統(tǒng)中補加一定物料，維持生物生長和生產(chǎn)所需要的營養(yǎng)或前體，介于分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵之間的一種發(fā)酵生產(chǎn)模式。
本文結(jié)合GMP最新要求和發(fā)酵的特點，歸納了四種常見的可定量的生物過程補料方式并簡述了其優(yōu)缺點：四種方式分別是火焰插針方式、可在線SIP的蠕動泵補料方式，以及基于流量計和計量杯的補料方式。
有幾個涉及補料的發(fā)酵參數(shù)，如pH和泡沫控制，可通過PID自動反饋調(diào)節(jié)。除此之外，更多補料如C源，N源，前體，誘導(dǎo)物，抑制劑等，它們在添加前需要對多個參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，往往不是一個，然后再根據(jù)經(jīng)驗規(guī)則制訂補加策略。由于目前還沒有一套可閉環(huán)控制的補料方案，所以需要不斷的根據(jù)參數(shù)變化來修改策略。 無論哪一種方式，都需要工藝人員掌握累積補料量和實時補料量，甚至對待它們要比測量的那些生理參數(shù)優(yōu)先級還要高，因此補料的定量控制能力成了對發(fā)酵設(shè)備的基本要求。同時，補料除了符合定量之外，還要考慮無菌因素和法規(guī)要求。
法規(guī)要求
新版GMP規(guī)定：發(fā)酵過程需補料操作時要求在無菌操作條件下進(jìn)行，應(yīng)事先對補充的物料配制后補料前進(jìn)行在位滅菌或過濾滅菌，應(yīng)對補料管路進(jìn)行滅菌保證無死角，應(yīng)采用密閉或封閉系統(tǒng)進(jìn)行補料。以上規(guī)定對食品和原料藥生產(chǎn)涉及的發(fā)酵過程的補料進(jìn)行規(guī)范，大大降低了因補料導(dǎo)致的質(zhì)量風(fēng)險。
小規(guī)模生物過程補料
傳統(tǒng)蠕動泵補料方式
①將配制好料液加到補料瓶a內(nèi)，并用硅膠管d將補料瓶a和補料針組件e連接好，然后將補料針組件包上紗布和牛皮紙后，整體再放入滅菌鍋內(nèi)滅菌；
②將滅菌后的硅膠管d安裝到蠕動泵c內(nèi)；
③對接種環(huán)境進(jìn)行消毒；
④在火焰保護(hù)下，將補料針刺穿補料組件上的硅膠塞，再旋緊補料針。
⑤打開發(fā)酵自控系統(tǒng)上的補料程序，進(jìn)行自動補料。
優(yōu)缺點：該工藝簡單實用，雖然實際染菌率很低，卻因為是敞口操作，沒有合適的驗證方案，經(jīng)常不被GMP審核員認(rèn)可，所以這種方法多見于試驗室。
具有SIP功能的補料方式
具體操作流程如下：
①將配制好料液加到補料瓶a，用硅膠管c將補料瓶a和補料隔膜閥e（含小排氣閥g、卡箍連接件i、j）連接好，關(guān)閉隔膜閥e后，整體放入滅菌鍋內(nèi)滅菌；
②將滅菌后的硅膠管c安裝到蠕動泵d內(nèi)，并用卡箍連接件i、j將補料隔膜閥門e、小排氣閥g與相應(yīng)管路連接好；
③打進(jìn)蒸汽閥h，打開小排氣閥g，稍微打開補料隔膜閥f，對補料管路進(jìn)行滅菌；
④滅菌完畢后關(guān)閉進(jìn)蒸汽閥h和小排氣閥g，打開補料隔膜閥e；
⑤打開計算機控制系統(tǒng)上的補料程序，進(jìn)行自動補料。
優(yōu)缺點：該方法最大的優(yōu)點就是可以對整個補料管路進(jìn)行在線SIP，徹底消除滅菌隱患，滿足GMP法規(guī)的要求，但是只能應(yīng)用于試驗罐或小規(guī)模發(fā)酵補料。
注意點：呼吸過濾器的完整性往往被用戶忽視，導(dǎo)致染菌而不自知。
大規(guī)模生物過程補料
基于流量計的補料
流量計一般選用質(zhì)量流量計、電磁流量計、渦街流量計等。其中質(zhì)量流量計適用于電導(dǎo)率低的介質(zhì)，測量精度可達(dá)到±0.25%；電磁流量計適用于電導(dǎo)率高的介質(zhì)，測量精度達(dá)到±0.5%；渦街流量計適用于電導(dǎo)率低的介質(zhì)，測量精度達(dá)到±0.75%，可根據(jù)實際情況要求選擇相應(yīng)的流量計。
流量計式補料系統(tǒng)工藝流程見上圖，流量計與氣動隔膜閥組成一個補料控制回路，流量計檢測累計補料量，氣動隔膜閥控制流加�？刂撇呗钥梢苑譃閮煞N：一種是與pH、DO、濁度等分析儀表進(jìn)行閉環(huán)控制，例如補堿、氨水、消泡劑等；另一種是按時間和數(shù)量進(jìn)行的流加控制，例如補硫胺、糖液等。
補料控制一般采用PID控制，每隔一個掃描周期采樣一次，與上次的數(shù)值進(jìn)行對比，通過PID算法將補料量轉(zhuǎn)換為開閥時間。
優(yōu)缺點：結(jié)構(gòu)簡單，功能強大，與計算機配合可實現(xiàn)自動補料工藝。缺點是對不同的補料通用性稍差，易受流量計前后壓力波動的影響等，但從長遠(yuǎn)看這是一種能夠替代計量杯補料的系統(tǒng)。
基于計量杯的補料方式
計量杯式補料系統(tǒng)在抗生素發(fā)酵生產(chǎn)中應(yīng)用較廣，其原理是把欲補充的營養(yǎng)物質(zhì)按計量罐的容積，根據(jù)補料速率，換算成相應(yīng)的時間，然后等間隔地流加進(jìn)發(fā)酵罐。
計量杯式補料系統(tǒng)工藝流程見上圖，主要由進(jìn)料隔膜閥、計量罐、高/低液位電極、出料隔膜閥等組成。具體操作流程如下：
①在發(fā)酵實罐滅菌時，對計量杯系統(tǒng)進(jìn)行滅菌，或者在補料前對料液分配系統(tǒng)進(jìn)行滅菌；
②滅菌完成后，關(guān)閉小排氣閥h和l，關(guān)閉進(jìn)料氣動隔膜閥b、出料氣動隔膜閥k，打開進(jìn)料手動隔膜閥j和壓力平衡閥；
③打開計算機控制系統(tǒng)上的補料程序，開始根據(jù)設(shè)定自動補料。
該補料方式的優(yōu)點是計量準(zhǔn)確，直觀，通用性好。
缺點是：使用高低液位電極原理的計量杯式補料系統(tǒng)僅適用于電導(dǎo)率高的液體，對于補油，需要將這種電極更換成光學(xué)傳感器；另外，這種方式涉及了大量的閥門管道，因此導(dǎo)致操作復(fù)雜，容易形成滅菌死角，且維護(hù)不方便，未來很可能被其他補料方式取代。
